Caracterización por citometría de flujo de las leucemias agudas

 

Autor : Francisco Javier López Villanueva

4º Curso de Medicina grupo "B" (curso 2025/26)

Código de trabajo : 2511-FLV

Conceptos Básicos de las Leucemias Agudas

Las leucemias agudas son proliferaciones clonales malignas de células hematopoyéticas inmaduras de tipo blástico que pueden afectar médula ósea, sangre periférica u otros tejidos. Podemos comenzar a hablar de leucemias agudas cuando encontramos un 20% o más de blastos en la médula ósea o sangre periférica. Además, distinguiremos 2 tipos fundamentales de leucemias en función de la línea hematopoyética afectada: las mieloblásticas, en las que la proliferación neoplásica corresponde a células de la línea mieloide (granulomonocítica, eritroide o megacariocítica), y las linfoblásticas, que afectan a los precursores linfoides (1).

Incidencia y Etiología

La incidencia de leucemia aguda en la población general es de 1 a 3 casos por cada 100.000 habitantes y año, con un ligero predominio masculino. La leucemia mieloide aguda tiene una incidencia que aumenta exponencialmente con la edad, mientras que la leucemia linfoide aguda es más frecuente en el paciente pediátrico. Esta última constituye el 15 – 20% de las leucemias agudas en el adulto (1).

Se desconoce la etiología de las leucemias agudas, aunque se sabe que los factores genéticos juegan un papel relevante en su aparición, ya que ciertas patologías congénitas como el síndrome de Down o la anemia de Fanconi asocian un riesgo leucémico aumentado. En cuanto a agentes externos implicados, la radiación y el benceno ocupan un lugar importante (1). Las infecciones virales (HTLV-1, VEB), los antecedentes de trastornos hematológicos y el tratamiento previo con algunos antineoplásicos también se han asociado a la aparición en algunas ocasiones de leucemias agudas (2).

Manifestaciones clínicas de las leucemias mieloblásticas agudas (LMA)

Los síntomas se deben al fallo medular por la proliferación leucémica y la infiltración de órganos y tejidos. Esta infiltración va a causar una interrupción de la hematopoyesis, provocando pancitopenias. El 80 – 90% de paciente presentará anemia normocítica normocrómica y trombopenia, las cuales pueden manifestarse provocando debilidad, palidez o diátesis hemorrágica, entre otros. La neutropenia estará presente en el 30 – 50% de enfermos y se manifestará a través de infecciones recurrentes o fiebre.

Además, los blastos pueden invadir la dermis causando normalmente lesiones papulonodulares indoloras y no pruriginosas. La infiltración de otros órganos es menos común en la LMA pero puede causar adenopatías y visceromegalias en el 10% de los pacientes. La infiltración meníngea es excepcional (1, 3).

Manifestaciones clínicas de las leucemias linfoblásticas agudas (LLA)

Las manifestaciones clínicas van a ser inespecíficas y muy similares a las de la LMA, ya que la pancitopenia es también muy frecuente en este tipo de leucemias agudas. Sin embargo, en la LLA hasta el 50% de los pacientes va a presentar adenopatías, esplenomegalia y hepatomegalia. También es frecuente la aparición de una masa mediastínica, la cual corresponde en casi todos los casos a un fenotipo inmunológico T. La afección neuromeníngea es más frecuente en este tipo de leucemias agudas con el 5 – 10% de los pacientes afectados, la cual provocará cefaleas, papiledema y parálisis de pares craneales (1, 4).

Clasificación de las leucemias mieloblásticas agudas (LMA)

En el año 1976 un grupo de expertos franceses, estadounidenses y británicos (FAB) decidió dividir las LMA en 8 subtipos, nombrados desde M0 a M7, según el tipo de célula del cual la leucemia se desarrolla (1, 5).

Tabla 1. Clasificación FAB de las LMA. Extraída de (6).

Sin embargo, la clasificación FAB no tomaba en cuenta muchos de los aspectos que actualmente se sabe que afectan al pronóstico. Debido a esto, la OMS realizó otra clasificación en 2016 teniendo en cuenta estos factores (5).

Tabla 2. Clasificación OMS de las LMA. Extraída de (6).

 

Clasificación de las leucemias linfoblásticas agudas (LLA)

Del mismo modo, el Grupo Cooperativo Franco-Americano-Británico (FAB) desarrolló una clasificación de las LLA basándose en la manera en que las células leucémicas lucían en el microscopio. Este sistema ha sido reemplazado por otras clasificaciones debido a que las nuevas técnicas de laboratorio permiten clasificar este tipo de leucemias con mayor precisión (7).

Tabla 3. Clasificación FAB de las LLA. Extraída de (8).

Posteriormente, la OMS realizó de nuevo otra clasificación de las LLA en 2016 separando dentro de estas 2 entidades: leucemias de precursores B y de precursores T. Dentro de esta distinción, los médicos descubrieron que las pruebas citogenéticas, la citometría de flujo y otras pruebas de laboratorio proporcionan información más detallada sobre el subtipo de LLA y el pronóstico de esta, realizando una clasificación en función del riesgo citogenético y molecular y otra en función del inmunofenotipo de la célula causante de la leucemia. De esta última clasificación nos encargaremos más adelante (1, 7).

Diagnóstico de las leucemias agudas

En base a lo expuesto anteriormente, se puede deducir que para el diagnóstico de las leucemias agudas serán necesarios un hemograma completo, un frotis de sangre periférica, un examen de médula ósea y, por último, estudios histoquímicos, citogenéticos e inmunofenotipado.

El hemograma, el frotis y el examen de médula ósea nos permitirán observar pancitopenias y un porcentaje ≥ 20% de blastos de la célula causante de la leucemia en sangre periférica o en la médula ósea.

Los estudios histoquímicos nos permitirán diferenciar los blastos de la leucemia linfoblástica y mieloblástica. Por otra parte, los estudios citogenéticos nos permitirán descubrir posibles alteraciones en los cromosomas y asociar a estas un mejor o peor pronóstico de la enfermedad. Por último, el inmunofenotipado se realizará principalmente a través de una citometría de flujo y nos permitirá caracterizar con exactitud el linaje y madurez de la célula leucémica a través de los antígenos que expresen estas células en su superficie (3, 4).

 

Principios de la Citometría de Flujo

La medición de las características físicas y químicas de las células se conoce como citometría. Esta medición puede realizarse de diversas formas, pero cuando se analizan las características de las células mediante una fuente de excitación mientras circulan en una corriente líquida se denomina citometría de flujo (CMF).

La gran difusión que ha tenido la CMF en la práctica médica se ha debido a cuatro aspectos fundamentales:

• El desarrollo de anticuerpos monoclonales y la demostración de su importancia en el diagnóstico y pronóstico de enfermedades.
• El perfeccionamiento de la tecnología basada en el empleo de luz láser.
• La revolución de los sistemas informáticos.
• El continuo desarrollo de nuevos fluorocromos.

El análisis de las células sanguíneas mediante inmunofluorescencia se basa en el empleo de los anticuerpos monoclonales para identificar los antígenos de diferenciación celular y en la detección posterior de la inmunofluorescencia mediante sistemas de detección. En resumen, el citómetro mide las características celulares a través de los cambios observados tras la interacción entre la luz emitida por un foco y la célula (9).

 
Componentes y Funcionamiento de la CMF

Para realizar estos análisis, los citómetros disponen de un sistema hidráulico para la circulación de las células en un flujo continuo monocelular, un sistema lumínico láser que incidirá sobre las células, un sistema óptico y eléctrico que recoge la luz dispersada y un sistema informático para almacenar y procesar los datos.

El primer paso del proceso lo lleva a cabo un sistema de fluidos, constituido por la cámara de flujo, punto central del citómetro, el cual se encarga de conseguir que las células pasen una por una por el punto de interrogación. Algunos citómetros también incorporan una unidad de separación o cell sorter que, además de analizar las células, permitirá separar físicamente subpoblaciones de una muestra en función a sus características morfológicas y de fluorescencia.

La interacción entre la célula y la luz láser se producirá en la cámara y la dispersión lumínica será recogida por los detectores de los diversos parámetros. Estos detectores se sitúan en la misma dirección de la luz incidente, denominada forward angle light scatter (FSC) o dispersión frontal de luz; de forma perpendicular (90º) a la luz incidente, denominada orthogonal scatter o side scatter (SSC) o dispersión lateral de luz; y por último están los detectores de fluorescencia (FL). El FSC reflejará el tamaño celular y el SSC reflejará la complejidad celular, lo cual incluye la granulación, características de membrana y presencia de estructuras internas.

El empleo de sustancias fluorescentes permitirá observar otras propiedades celulares. La mayoría de los citómetros actuales disponen de detectores para varias fluorescencias. Los detectores de fluorescencia recogerán la luz de determinadas longitudes de onda. Por último, la señal recibida en estos sistemas ópticos será amplificada por fotomultiplicadores y convertida a lenguaje analógico para ser procesada por el sistema informático incorporado al citómetro (9, 10).

Empleo de Láseres y Fluorocromos

Como hemos dicho previamente, la tecnología de la CMF nos permite medir la fluorescencia asociada a células que han sido previamente marcadas con anticuerpos monoclonales ligados a fluorocromos, como por ejemplo CD3-FITC, donde CD3 representa un anticuerpo monoclonal que reacciona contra ese determinado antígeno de superficie celular y FITC representa un fluorocromo. Los citómetros de flujo también son capaces de medir la disminución de sondas fluorescentes.

Es necesario tener en cuenta que estos fluorocromos y conjugados comerciales generalmente se excitan sólo por un tipo de láser que emite luz a una determinada longitud de onda. Normalmente, los citómetros poseen un láser que excita a 488 nm (láser de argón azul) y que permite la excitación simultánea de fluorocromos como FITC, cuyo pico de emisión es de 525 nm, o PerCP, que emite a 675 nm. Cada pico de emisión será leído por detectores distintos. Sin embargo, se pueden emplear otros láseres como un láser rojo HeNe, que emite luz a 633 nm, o láser violeta, que emite luz a 405 nm, entre otros.

Por último, es muy importante ajustar los parámetros del citómetro y compensar correctamente para evitar solapamientos entre las emisiones de cada uno de los fluorocromos. Para esto se pueden usar controles de fluorescencia, que consisten en anticuerpos monoclonales sin reactividad específica y que están ligados al mismo fluorocromo que el anticuerpo a analizar. Posteriormente, se compararán las fluorescencias obtenidas en las células unidas al anticuerpo monoclonal a estudiar con los resultados de los controles de fluorescencias para delimitar la positividad o negatividad de la muestra (9, 11).

Imagen 1. Componentes básicos de un citómetro de flujo. Extraída de (10).

 

Interpretación de Resultados

El citómetro permite definir y cuantificar poblaciones heterogéneas gracias a la medición de diversos parámetros. El análisis de datos de la citometría de flujo se basa en el principio del sistema de ventanas, donde cada punto que aparezca en el gráfico representa una célula. En general, la ventana se realiza en la señal de FSC y SSC, pero puede realizarse en las fluorescencias. Al correlacionar FSC y SSC, se pueden diferenciar las poblaciones de linfocitos, monocitos y granulocitos por sus diferencias en tamaño (FSC) y complejidad (SSC) (9, 12).

Además, los datos recogidos por el citómetro de flujo suelen analizarse utilizando 2 tipos de gráficas diferentes:

Histogramas: muestran la intensidad de expresión de un marcador. El desplazamiento de la curva hacia la derecha indica mayor expresión del marcador, mientras que la altura del pico indica cuántas células han sido capturadas expresando con determinada intensidad dicho marcador (13).

Imagen 2. Histograma. La población de células positivas al marcador CD44

 está representado por el pico de la derecha. Extraída de (13).

Gráfica de puntos: muestra la relación entre 2 marcadores diferentes y muestra a cada uno como un evento (cualquier partícula que haya sido excitada por el láser) (13).

Imagen 3. Gráfica de puntos. Compara FSC en abscisas 

vs SSC en ordenadas. Extraída de (12).

 

Aplicaciones de la Citometría de Flujo

La CMF nos permite analizar varios tipos de células, abarcando desde la plaqueta hasta el megacariocito. Además, nos permite analizar entre 5.000 y 300.000 células de un espécimen, llegando a detectar hasta 1.000 moléculas por célula. Esto último es especialmente útil para conocer el número de determinantes antigénicos de un espécimen siempre y cuando utilicemos un anticuerpo monoclonal marcado con un fluorocromo válido para la detección de este y apto para las características del citómetro, es decir, que se excite con la longitud de onda del láser y emita dentro de los límites de onda detectables por su sistema.

Esto último es especialmente importante ya que, en hematología, la aplicación más usual del citómetro de flujo va a ser la inmunofenotipificación, la cual sirve para el estudio de antígenos de superficie para el diagnóstico de las leucemias agudas y crónicas, así como la caracterización de sus poblaciones linfocíticas.

Sin embargo, la CMF no sustituye a otras técnicas de laboratorio para la detección de antígenos nucleares o citoplasmáticos, como la enzima nuclear Tdt o la presencia de mieloperoxidasa (MPO). Además, cuando la población patológica representa un pequeño porcentaje del total, su interpretación por citometría puede ser difícil (9).

 

Antígenos de Diferenciación

Como se puede suponer, la llegada de la tecnología de los anticuerpos monoclonales revolucionó la clasificación de los antígenos de superficie celular. Estos permitieron el estudio e identificación de moléculas de superficie linfoides o mieloides específicas que se desconocían previamente. Sin embargo, al crecer el número de anticuerpos monoclonales específicos de antígenos de diferenciación de la superficie celular, se hizo patente la necesidad de una normalización internacional. De este modo, a un antígeno reconocido por un conjunto de anticuerpos se le asigna un número de CD (cluster of differentation) o grupo de diferenciación (14).

De este modo, gracias al uso de anticuerpos monoclonales que reconocen CD distintos, se puede caracterizar a las leucemias agudas en linfoides o mieloides en base a los antígenos de superficie que expresan sus células ya que cada línea expresará antígenos específicos de ese linaje. Además, los CD también permiten averiguar la madurez de las células leucémicas ya que en la hematopoyesis, conforme las células maduran, estas dejan de expresar unos antígenos de superficie y pasan a expresar otros.

En base a este principio, la OMS en 2016 caracterizó a las leucemias en mieloides o linfoides en base a los antígenos que expresan. Además, como hemos dicho anteriormente, también realizó en ese mismo año una clasificación de las LLA según si la célula leucémica pertenece a la línea B o T y, dentro de estas, si la célula pertenece a un estadio evolutivo con mayor o menor madurez.

Tabla 4. Panel de anticuerpos monoclonales específicos de línea 

para la clasificación de las leucemias agudas (OMS). Extraída de (1).

Tabla 5. Clasificación por inmunofenotipo de las LLA. Extraída de (15).

BIBLIOGRAFÍA

1. Sans-Sabrafen J, Besses Raebel C, Vives Corrons JL. Hematología Clínica. Quinta Edición. Elsevier; 2006.

2. Manual MSD versión para profesionales [Internet]. [citado 17 de marzo de 2026]. Generalidades sobre las leucemias - Hematología y oncología. Disponible en: https://www.msdmanuals.com/es/professional/hematología-y-oncología/leucemias/generalidades-sobre-las-leucemias

3. Manual MSD versión para profesionales [Internet]. [citado 18 de marzo de 2026]. Leucemia mieloide aguda (LMA) - Hematología y oncología. 

Disponible en: 

https://www.msdmanuals.com/es/professional/hematología-y-oncología/leucemias/leucemia-mieloide-aguda-lma

4. Manual MSD versión para profesionales [Internet]. [citado 18 de marzo de 2026]. Leucemia linfoblástica aguda (LLA) - Hematología y oncología. 

Disponible en: 

https://www.msdmanuals.com/es/professional/hematología-y-oncología/leucemias/leucemia-linfoblástica-aguda-lla

5. ¿Cómo se clasifica la leucemia mieloide aguda? [Internet]. [citado 18 de marzo de 2026]. 

Disponible en: https://www.cancer.org/es/cancer/tipos/leucemia-mieloide-aguda/deteccion-diagnostico-clasificacion-por-etapas/como-se-clasifica.html

6. Lagunas-Rangel FA. Leucemia mieloide aguda. Una perspectiva de los mecanismos moleculares del cáncer. GAMO. 1 de mayo de 2016;15(3):150-7. doi:10.1016/j.gamo.2016.05.007

7. Subtipos y factores pronósticos de la leucemia linfocítica aguda [Internet]. [citado 18 de marzo de 2026]. Disponible en: https://www.cancer.org/es/cancer/tipos/leucemia-linfocitica-aguda/deteccion-diagnostico-clasificacion-por-etapas/como-se-clasifica.html

8. Pico Sánchez DF, Rosero Freire DA. Bionatura journal [Internet]. [citado 18 de marzo de 2026]. De la microscopía a la secuenciación genética: La evolución en las técnicas de diagnóstico de la Leucemia Linfoide Aguda. Disponible en: http://bionaturajournal.com/2025.02.01.11.html

9. Vives Corrons JLl, Aguilar Bascompte JL. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. 3a Edición. Elsevier; 2006.

10. Cajal I. Neurobaraja: comodin de oros. Instituto Cajal - CSIC [Internet]. 1 de febrero de 2024 [citado 19 de marzo de 2026]. Disponible en: https://cajal.csic.es/neurobaraja-comodin-de-oros/

11. Citometría de flujo | British Society for Immunology [Internet]. [citado 21 de marzo de 2026]. Disponible en: 

https://www.immunology.org/es/public-information/inmunolog%C3%ADa-bitesized/experimental-techniques/citometria-de-flujo

12. ¿CUÁNTO SABES ACERCA DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO? [Internet]. 19 de enero de 2022 [citado 19 de marzo de 2026]. Disponible en: https://cscmetabolism.com/2022/01/19/cuanto-sabes-acerca-de-la-citometria-de-flujo/

13. Uriostegui P, Nelly L. Fundamentos de citometría de flujo. 2022.

14. Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, Kipps TJ, Seligsohn U. Williams Hematología. 6a Edición. Vol. 1. Marbán; 2005.

15. Moreta, V, Rosero D. Bionatura journal [Internet]. [citado 20 de marzo de 2026]. Avances en inmunoterapia para leucemia linfocítica aguda: integración de terapias con células car-T y otras estrategias inmunológicas. Disponible en: http://bionaturajournal.com/2025.02.01.15.html